Fluoreszentzia-iragazkia fluoreszentzia-mikroskopioan funtsezko osagaia da. Sistema tipiko batek oinarrizko hiru iragazki ditu: kitzikapen-iragazkia, igorpen-iragazkia eta ispilu dikroikoa. Kubo batean bildu ohi dira, taldea mikroskopioan txertatzeko.
Nola funtzionatzen du fluoreszentzia-iragazkiak?
Zirrara-iragazkia
Kitzikapen-iragazkiek uhin-luzera zehatz bateko argia transmititzen dute eta beste uhin-luzerak blokeatzen dituzte. Kolore desberdinak ekoizteko erabil daitezke iragazkia sintonizatuz kolore bakarra igarotzeko. Kitzikapen-iragazkiak bi mota nagusitan daude: pasabide luzeko iragazkiak eta banda-iragazkiak. Exzitatzailea normalean fluoroforoak xurgatutako uhin-luzerak soilik igarotzen dituen banda-iragazkia da, eta, horrela, beste fluoreszentzia-iturri batzuen kitzikapena minimizatzen du eta fluoreszentzia-igorpen-bandan kitzikapen argia blokeatzen du. Irudiko marra urdinak erakusten duen bezala, BP 460-495 da, hau da, 460-495nm-ko fluoreszentziatik soilik igaro daiteke.
Fluoreszentzia-mikroskopio baten argiztapen-bidearen barruan kokatzen da eta argi-iturriaren uhin-luzera guztiak iragazten ditu fluoroforoaren kitzikapen-eremua izan ezik. Iragazkiaren transmisio minimoak irudien distira eta distira agintzen du. Edozein kitzikapen-iragazkientzako gutxienez % 40ko transmisioa gomendatzen da, transmisioa hobeki % 85 izan dadin. Kitzikapen-iragazkiaren banda-zabalerak fluoroforoaren kitzikapen-tartearen barruan egon behar du, iragazkiaren erdiko uhin-luzera (CWL) fluoroforoaren kitzikapen gailurreko uhin-luzera ahalik eta hurbilen egon dadin. Kitzikapen-iragazkiaren dentsitate optikoak (OD) atzeko irudiaren iluntasuna agintzen du; OD iragazki batek transmisio-eremutik edo banda-zabaleratik kanpo uhin-luzerak nola blokeatzen dituen neurtzen du. Gutxieneko OD 3,0 gomendatzen da, baina OD 6,0 edo handiagoa da aproposa.
Isuri-iragazkia
Igorpen-iragazkiek laginaren fluoreszentzia desiragarria detektagailura heltzeko balio dute. Uhin-luzera laburragoak blokeatzen dituzte eta transmisio handia dute uhin-luzera luzeagoetarako. Iragazki mota ere zenbaki batekin lotzen da, adibidez BA510IF irudian (interferentzia-hesiaren iragazkia), izendapen horrek bere transmisio maximoaren %50eko uhin-luzerari egiten dio erreferentzia.
Kitzikapen-iragazkien gomendio berdinak dira igorpen-iragazkien kasuan: gutxieneko transmisioa, banda-zabalera, OD eta CWL. CWL, gutxieneko transmisioa eta OD konbinazio aproposa duen igorpen-iragazki batek ahalik eta irudi distiratsuenak eskaintzen ditu, ahalik eta blokeorik sakonenarekin, eta igorpen-seinale ahulenen detekzioa bermatzen du.
Ispilu dikroikoa
Ispilu dikroikoa kitzikapen-iragazkiaren eta igorpen-iragazkiaren artean jartzen da 45°-ko angeluan eta kitzikapen-seinalea fluorofororantz islatzen du igorpen-seinalea detektagailurantz igortzen duen bitartean. Iragazki dikroiko eta izpi-banatzaile idealak islada maximoaren eta transmisio maximoaren arteko trantsizio zorrotzak dituzte, %95eko islada bat kitzikapen-iragazkiaren banda zabalerako eta %90eko transmisioa igorpen-iragazkiaren banda zabalerako. Hautatu iragazkia fluoroforoaren ebakidura-uhin-luzera (λ) kontuan hartuta, argi galdua minimizatzeko eta irudi fluoreszenteen seinale-zarata erlazioa maximizatzeko.
Irudi honetako ispilu dikroikoa DM505 da, 505 nanometroak ispilu honen transmisio maximoaren % 50eko uhin-luzera delako. Ispilu honen transmisio-kurbak 505 nm-tik gorako transmisio handia erakusten du, transmisioaren jaitsiera handia 505 nanometrotik ezkerrera eta 505 nanometrotik ezkerreko isladagarritasun maximoa, baina oraindik ere transmisioren bat izan dezake 505 nm-tik behera.
Zein da pasabide luzeko eta bandako iragazkien arteko aldea?
Fluoreszentzia-iragazkiak bi motatan bana daitezke: pasabide luzea (LP) eta pasabide banda (BP).
Iragazki luzeek uhin luzeak transmititzen dituzte eta laburragoak blokeatzen dituzte. Moztutako uhin-luzera gailurraren transmisioaren % 50eko balioa da, eta ebakiduraren gaineko uhin-luzera guztiak pasabide luzeko iragazkiek transmititzen dituzte. Ispilu dikroikoetan eta igorpen-iragazkietan maiz erabiltzen dira. Pasabide luzeko iragazkiak erabili behar dira aplikazioak emisio-bilketa maximoa eskatzen duenean eta bereizketa espektrala desiragarria edo beharrezkoa ez denean, hori gertatzen da, oro har, hondoko autofluoreszentzia maila nahiko baxua duten aleetan igorpen-espezie bakarra sortzen duten zundetan.
Banda-iragazkiek uhin-luzera-banda jakin bat soilik transmititzen dute, eta beste batzuk blokeatzen dituzte. Crosstalk murrizten dute, fluoroforoen igorpen-espektroaren zatirik indartsuena soilik transmititzea ahalbidetuz, autofluoreszentzia zarata murrizten dute eta, horrela, seinale-zarata erlazioa hobetzen dute hondo handiko autofluoreszentzia laginetan, pasabide luzeko iragazkiak eskaini ezin dituztenak.
Zenbat fluoreszentzia-iragazki-multzo horni ditzake BestScope-k?
Ohiko iragazki mota batzuk urdinak, berdeak eta ultramoreak dira. Taulan agertzen den bezala.
| Iragazki multzoa | Zirrara-iragazkia | Ispilu dikroikoa | Hesi-iragazkia | LED lanpara Uhin Luzera | Aplikazioa |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Antigorputz fluoreszenteko metodoa ·Azidina laranja: DNA, RNA ·Auramina: Tuberkulu baziloa ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rodamina, TRITC: Antigorputz fluoreszenteen metodoa ·Propidio ioduroa: DNA · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Autofluoreszentziaren behaketa ·DAPI: DNAren tindaketa ·Hoechest 332528, 33342: kromosomak tindatzeko erabiltzen da |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Katekolaminak ·5-hidroxi triptamina ·Tetraziklina: Hezurdura, Hortzak |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·H5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Fluoreszentzia-eskuraketetan erabiltzen diren iragazki-multzoak fluoreszentzia-aplikazioetan erabiltzen diren uhin-luzera nagusien inguruan diseinatzen dira, gehien erabiltzen diren fluoroforoen inguruan oinarrituta. Hori dela eta, irudiak egiteko pentsatuta dagoen fluoroforoaren izena ere jasotzen dute, hala nola DAPI (urdina), FITC (berdea) edo TRITC (gorria) iragazki kuboak.
| Iragazki multzoa | Zirrara-iragazkia | Ispilu dikroikoa | Hesi-iragazkia | LED lanpara Uhin Luzera |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramina | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas Gorria | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Nola aukeratzen duzu fluoreszentzia-iragazkia?
1. Fluoreszentzia-iragazkia hautatzeko printzipioa fluoreszentzia/igorpen-argia irudiaren amaieratik ahalik eta gehien igarotzen uztea da, eta aldi berean kitzikapen-argia guztiz blokeatzea, seinale-zarata erlazio handiena lortzeko. Batez ere fotoi anitzeko kitzikapena eta barne islapen mikroskopio osoa aplikatzeko, zarata ahulak ere interferentzia handiak eragingo ditu irudi-efektuan, beraz, seinalearen eta zarata erlazioaren eskakizuna handiagoa da.
2. Fluoroforoaren kitzikapen eta igorpen espektroa ezagutzea. Hondo beltz batekin kalitate handiko eta kontraste handiko irudia sortzen duen fluoreszentzia-iragazki-multzo bat eraikitzeko, kitzikapen- eta igorpen-iragazkiek transmisio handia lortu behar dute fluoroforoaren kitzikapen-gailur edo emisioei dagozkien eskualdeetan pasabide-banda minimoarekin.
3. Kontuan hartu fluoreszentzia-iragazkien iraunkortasuna. Iragazki hauek iragazgaitzak izan behar dute "erreketa" eragin dezakeen argi ultramorea (UV) sortzen duten argi-iturri biziak, batez ere kitzikapen-iragazkia, argiztapen iturriaren intentsitate osoa jasaten baita.
Fluoreszenteen Lagin Irudi desberdinak
Baliabideak Interneten bildu eta antolatzen dira, eta ikasteko eta komunikatzeko soilik erabiltzen dira. Arau-hausteren bat izanez gero, jar zaitez gurekin harremanetan ezabatzeko.
Argitalpenaren ordua: 2022-12-09